细胞色素P4502D6基因Xba I限制性片段长度多态性及点突变与帕金森病的关系

[第1楼 PID2260] 2007-09-03 19:02 卡丁车 写道:

细胞色素P4502D6基因Xba I限制性片段长度多态性及点突变与帕金森病的关系

　　
细胞色素P4502D6基因Xba I限制性片段长度多态性及点突变与帕金森病的关系

陶恩祥　刘焯霖　陈彪　潘锡榜　邵明
510120 广州，中山医科大学孙逸仙纪念医院神经科(陶恩祥)，第一附属医院神经内科(刘焯霖、潘锡榜、邵明)；美国帕金森病研究所(陈彪)

关键词: 帕金森病；细胞色素P450；羟化酶类；多态性；限制性片段长度

　　【摘要】　目的　探讨机体的第I相解毒系统障碍与帕金森病(PD)遗传易患性的关系。方法　选择PD病人100例和正常人100名，利用Xba I限制性片段长度多态性(RFLP)和PCR-RFLP技术，检测细胞色素P4502D6(CYP2D6)基因的突变。比较PD病人与正常人之间多态性频率的差异。结果　Xba I RFLP分析可见PD病人组44 kb等位基因频率，以及44 kb/44 kb纯合子的频率高于正常对照组，而且在病人组A、B、C188→T、C4268→C、C2938→T点突变频率也高于正常对照组，使患PD的危险性提高，危险度达2.0倍左右。结论　解毒酶CYP2D6基因突变增加患PD的危险性。这提示解毒酶缺陷可能是PD遗传易患性的重要原因。

　　虽然近来多数学者认为帕金森病(PD)是环境毒素与遗传易患性相互作用所致［1］，但是遗传易患性的实质尚不清楚。环境中的毒素，如神经毒素甲基-苯基-四氢吡啶(MPTP)等进入人体后，需通过第I相解毒酶细胞色素P4502D6(CYP2D6)的羟化过程；再经过第Ⅱ相解毒酶的作用，达到彻底解毒［2］。PD的遗传易患性是否由这些解毒酶多态性所决定?我们对一组PD病人和正常人的I相解毒的CYP2D6酶基因的Xba I限制性长度多态及点突变做了对照研究，以阐明该酶缺陷对PD发病影响。

资料和方法
　　1.病例的选择：100例特发性PD病人均根据全国第一届锥体外系会议制订的PD诊断标准确诊为特发性PD。其中男53例，女47例；年龄41～79岁，平均63岁。
　　2.对照组的选择：100名正常人，均来自门诊健康查体的人员，排除锥体外系、类风湿等疾病。年龄35～70岁，平均57岁。其中男性55名，女性45名。
　　3.DNA的提取：抽静脉血10 ml，肝素抗凝，利用常规酚/氯仿抽提法提取DNA。
　　4.CYP2D6基因分析：CYP2D6基因的突变包括插入性、缺失性和点突变三大类［3，4］。
　　(1)对于缺失性或插入性CYP2D6基因突变的检测利用Xba I限制性片段长度多态法：Xba I限制性片段长度多态分析：为10 μg基因组DNA用50单位Xba I限制性内切酶(宝灵曼产品)消化过夜后，在0.5%的琼脂糖凝胶上电压为0.5 V/cm电泳48小时，然后转移至尼龙膜上，用地高辛DNA标记检测试剂(宝灵曼产品)标记的CYP2D6 cDNA探针(由美国帕金森研究所提供)杂交显色，可见到44、29、13和11.5 kb片段(图1)。其中44 kb片段为CYP2D6基因带有插入序列，引起酶活性有降低；13、11.5 kb片段表示CYP2D6基因的两种缺失性突变，分别称为D和E突变，引起酶活性的缺乏。

1，5，7：29 kb纯合子
2，3：29 kb/44 kb纯合子
6：44 kb/44 kb纯合子
4：29 kb/13 kb杂合子
图1　基因组DNA的Xba I限制性片段长度多态性分析

　　(2)CYP2D6基因点突变的检测：CYP2D6基因点突变分为酶缺乏的A、B突变和酶活性降低的C188→T、C2938→T和G4268→C突变，均引起限制性内切酶位点的改变［3，4］，故采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测这几种突变，其中C188→T、C2938→T和G4268→C突变的PCR引物序列、PCR扩增条件和选用的特异性内切酶见表1，酶切电泳图谱分别见图2～4。CYP2D6 A、B检测方法详见文献［3］。

表1　CYP2D6基因188、2938和4268位点突变PCR引物序列、扩增条件和特异性酶切位点变化

突变原因
引物的序列
引物的位置
热循环条件
酶切点变化　

C188→T
5′-CATTTGGTAGTGAGGCAGGT-3′
69～88
95℃ 30s,59.5℃
Hph I(+)　

　
5′-CTCCAGGACCTCCTCCCTC-3′
289～271
30s, 72℃ 50s
　

C2938→T
5′-GCGGAGCGAGAGACCGAGGA-3′
2098～2117
95℃ 30s, 58.5℃
Hha I(-)　

　
5′-CCGGCCCTGACACTCCTTCT-3′
3200～3181
45s, 72℃ 2min
　

C4268→C
5′-TCAAGTGGGGAGACAAAC-3′
3623～3640
95℃ 30 s, 60℃
Bst EII (+)　

　
5′-ATATAGCTCCCTGAGCGCC-3′
4810～4793
45 s,72℃ 2min
　


　　(-)：表示酶切点丢失：(+)：表示产生新的酶切点

结果
　　一、正常人与PD病人染色体DNA Xba I RFLP分析的对照(表2)

表2　正常对照组与PD病人的Xba I RFLP各基因型(kb)的分析

　组别
例数
44/44
29/29
29/44
29/13
44/13

正常对照
55
5
26
23
1
0

PD病人
63
9
22
30
1
1

OR值
　
2.42
0.64
1.31
1
　







M:PGE-Zf(+)/Hae III DNA marker
1,5:C188/T188杂合子
2,3,4:T188/T188突变纯合子
图2　CYP2D6基因第188位点突变的PCR-RFLP凝胶电泳图
1:T2983/T2983突变纯合子
2,4,5:T2983/C2983杂合子
3,6,7:C2983/C2983突变纯合子
图3　CYP2D6基因第2938位点突变的PCR-RFLP凝胶电泳图


M:pBR328/BgI和pBR328/Hinf I DNA marker
1,8:C4268/C4268杂合子
2～7,9:G4268/C4268突变纯合子
图4　CYP2D6基因第4268位点突变的PCR-RFLP凝胶电泳图

　　由表2可见Xba I RFLP的44 kb/44 kb纯合子的危险性较正常对照组的频率高，危险性较其他基因型高2.4倍。而且29 kb/44 kb杂合子的危险性也有增高(提高1.31倍)。但是，这几种基因型在对照组与PD病人组之间未见统计学的差异(P>0.05)。
　　二、PD病人与正常人CYP2D6基因突变频率的对照分析(表3)

表3　PD病人与正常人CYP2D6基因突变频率的对照分析

组别
点突变
Xba I RFLP

n
A
B
T188
C4268
T2938
n
44 kb
29 kb
13 kb

对照组
200
0.02
0.03
0.57
0.63
0.20
110
0.31
0.68
0.01

PD病人组
200
0.05
0.10
0.67
0.71
0.39
126
0.40
0.59
0.01

OR值
　
2.01
2.23
1.52
1.40
2.58
　
1.47
0.36
1.00

P值
　
>0.05
>0.05
0.05
0.11
0.01
　
0.16
0.13
>0.50


　　注：n为受检基因数

　　表3可见CYP2D6基因A、B突变，第188位点的C→T和第4268位点的G→C，使患PD的危险度提高。PD病人组第2938位点的C→T突变使患PD的危险度增加2.58倍。在Xba I RFLP分析中，可见PD病人组的44 kb RFLP频率较对照组高，带有这种多态性的个体患病的危险度轻度提高(OR=1.47)。

讨论
　　研究发现除了环境因素与PD的发病有关外，国内外流行病学调查还发现PD有一定的家族密集性，而且发现PD病人及其血亲对酚噻嗪类药物的代谢异常，容易出现毒副反应［2］。因此，有人提出PD病人体内可能存在由遗传控制的对环境毒素代谢的某个环节缺陷的假设［1］。
　　通过对该基因的Xba I RFLP分析可见，PD病人组具有插入性突变的44 kb限制性片段的频率较对照组高，带有44 kb个体PD的危险性增高，尤其是纯合子的个体、患PD的危险性提高2.42倍。已经证明，该基因出现44 kb多态性，造成酶活性的表达下降［5］，因此该结果提示：酶活性的缺陷可能与PD有关。结果还发现，该基因的Xba I 13、11.5 kb RFLP即D和E突变的频率较低，未得到在病人组和对照组之间统计意义可能与标本量少有关。在CYP2D6酶基因点突变中：A、B、C188→T、G4268→C、C2938→T的突变均增加PD的患病危险性，每种突变对于患PD的危险性提高近2倍左右。通过对于该基因多种突变形式的研究提示CYP2D6基因的突变确实增加了PD发病的易患性，结果与国外报道一致［5］。
　　环境中的毒素(如神经毒素MPTP等)进入人体后，通过一系列酶作用，使酶素降解［2］。CYP2D6酶酶活性的缺陷将可能导致体内某些毒素的蓄积，引起继发性损害。从本实验结果可见，虽然该酶基因突变与PD具有关系，但是仍有许多PD病人不存在该基因突变，这并不能否定解毒系统与PD的关系，可能因为机体解毒系统复杂，只有对于解毒系统进行全面研究，才能完全确定它们与PD的关系。
　

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