重组腺相关病毒介导的帕金森氏病基因治疗研究进展

[第1楼 PID1092] 2007-07-18 11:21 春香 写道:

重组腺相关病毒介导的帕金森氏病基因治疗研究进展

摘要：本文综述近年来以重组腺相关病毒载体转导基因，在纹状体直接定位释放左旋多巴治疗帕金森氏病的进展。

关键词：帕金森氏病 左旋多巴 四氢生物蝶呤（BH4） 黑质 基因治疗

帕金森氏病（Parkinson’s disease ,PD）是一种常见于中老年人的中枢神经系统变性疾病，以震颤、肌强直和运动减少为典型临床表现，其主要病理特征为黑质纹状体系统多巴胺（Dopamine ,DA）能神经元进行性死亡、缺失。
自60年代初发现左旋多巴（L-Dopa）以来，口服左旋多巴一直是治疗PD的主要手段。然而，绝大部分病人从开始服药后平均6年[1,2]，就不可避免地诱发出现多种运动方面的并发症,主要表现为不自主运动、“耗尽”效应、“开—关”现象、“剂末运动不能”现象等[2,3,4,5]，这些并发症因病情的进展，药效缩短或血药浓度波动而引起。此外，还有精神方面的副作用，如产生幻觉和妄想等[6]。并发症的产生使得左旋多巴的治疗窗口大大缩小。虽然后来有研究者发现持续静脉滴注左旋多巴可减轻口服左旋多巴治疗诱发的许多副反应[7-10]，如“耗尽”效应，“开—关”运动波动和剂量峰值运动障碍等[10]，但是长期的左旋多巴持续滴注不仅不方便普遍实行，而且仍有潜在的精神副作用。
鉴于常规左旋多巴治疗的副作用，八十后代末期，国外通过移植胎儿黑质细胞至患者尾核直接释放多巴胺来治疗PD[11-14]。这些实验表明，此种策略治疗PD是很有发展前途的。然而，胎儿组织的来源困难以及涉及到的伦理学问题限制了其发展[15]。作为一种替换选择，遂采用重组的病毒载体或基因修饰过的纹状体细胞来产生左旋多巴 [16]。
近年来， PD基因治疗的策略多种多样，均取得了一定的进展。但由于不论是通过基因治疗还是口服来给予左旋多巴的替代疗法均不能阻止黑质纹状体的进展性病变，而用一些载体介导基因转移来表达特定的治疗性氨基酸、左旋多巴却可弥补这一缺陷。本文仅对近几年以重组腺相关病毒（Recombined adeno-associated virus, rAAV）载体转导基因，在纹状体直接定位释放左旋多巴的PD基因治疗研究概况作一综述。

1． rAAV载体
野生型腺相关病毒（Wild-type adeno-associated virus， WtAAV）是一种广泛寄生于人体的非致病病毒，基因组为单链DNA[17]。感染后，其基因组整合到宿主细胞染色体而形成隐性感染。只有依赖于其它辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等）的存在或其他因素（如γ射线和紫外线照射，铬基脲等）的作用，才能诱使腺相关病毒（Adeno-associated virus ,AAV）基因表达，使其复制，释放出子代[17,18]。AAV病毒因有一些独特优点如野生型AAV不致病，转染后的细胞无体内免疫反应，转基因的长期表达以及病毒粒子的稳定性使其成为最有吸引力的转基因工具之一[19,20,21]。
构建rAAV载体时，要去除病毒的二个末端反向重复序列（IRTs）之间的基因，代以目的基因[17]。再把带有Rep和Cap基因（Rea和Cap是与病毒复制及整合有关的蛋白）的质粒和制备好的载有目的基因序列的质粒共同转染培养细胞，方可获得rAAV载体制剂粗品[17]。一般在此类研究中，辅助病毒—腺病毒只用于提供包装功能。现已发现可表达腺病毒蛋白的新质粒，因而有可能制得非腺病毒依赖性的rAAV载体制剂[22,23]。得到的rAAV载体制剂需经多步纯化，以除去其中的辅助病毒，被污染的细胞和腺病毒蛋白以及核酸[17,18]。这种载体可冷冻贮藏于生理缓冲液中达数年之久，用前冻融即可。AAV的外源基因装载容量大约为5KB。
在多巴胺的生物合成过程中，酪氨酸首先在酪氨酸羟化酶（TH）及协同因子四氢生物蝶呤（BH4）的作用下转变为左旋多巴，这是多巴胺合成的限速步骤[24]。左旋多巴又在芳香性L-氨基酸脱羧酶（或多巴脱羧酶，AADC）的作用下脱羧转化为多巴胺[24,25]。其中BH4是在含TH的多巴胺神经元内由GTP合成而来的。此过程的第一步由GTP环水化酶I（GTPCHI）作用于GTP，这也是一限速步骤（如下图）。GTPCH1通过调控TH的活性，间接地控制多巴胺的合成量[26,27]。因此，通过构建rAAV-TH载体及其他相关的rAAV载体来转染细胞，进行纹状体内转导，可直接释放左旋多巴、产生DA。
GTP
↓GTPCHI
NH2P3
↓pyruvoyltetrahydropterin synthase
PPH4
↓sepiapterin reductase
BH4
tyrosine───→L-dopa───→dopamine
TH AADC

2. rAAV介导的大脑内基因表达
2．1 rAAV介导纹状体内转基因表达的证据
Kaplitt等人首次报道了用rAAV进行纹状体内基因转移的研究[19]。在研究中，Kaplitt等人注射滴度为5×106IU/ML的rAAV-TH至纹状体，获得了20％的转导效率[19]。然而，随后另外两个实验的数据表明，rAAV纹状体内转导率大约为0.1％。其中一个用rAAV-LacZ载体，另一个用rAAV-TH载体，两者均采用巨细胞（CMV）内部启动子来控制[28]。这一结果和Kaplitt等人的实验结果[19]相差200倍。究其原因，可能是Kaplitt等人用的rAAV载体含有污染物，而此种污染物有助于其转导[29]。不过这种说法纯属推测。也可能是他们采用的滴度单位衡定标准不同所致[30]。
在不同的解剖学部位rAAV转导效率不同。在中隔膜的转导（7—19％）要比黑质（Substantia nigra ,SN）的（5%）更高[31]，这说明在转导越容易进行的部位，介导rAAV进入细胞的受体就越多。最近发现细胞膜上广泛分布的HPSG分子是rAAV进入细胞的受体[32]。此外还有两个受体—FGF受体1（与HPSG组成二聚体而构成完整功能的受体）和V5受体也被认为是AAV的共同受体[33,34]。据报道，FGFR1确实选择性分布于小鼠大脑的中膈膜和黑质部[35]。
2．2 rAAV介导基因表达的神经特性
Kaplitt等人利用切片来观察rAAV介导转基因表达产生的神经特异性形态学，证实了其在大脑内的确切表达[19]。其后一些注射更高滴度rAAV载体制剂的实验证实，其转导产生了高度特异性的神经表达模式[28,31,36,37]。比如，McCown等人报道了用高滴度的rAAV载体介导LacZ基因在纹状体、海马趾和嗅结节神经中的表达[37]。rAAV转导神经细胞的比率和所用的启动子无关。研究者用不同的启动子—鼠白血病病毒（MOMULV）启动子和MFG启动子控制的rAAV-hTH载体[38]，结果显示转导神经细胞的比率一致。随后又有报道用胶质纤维酸蛋白启动子[39]和NSE（the neuron-specific enolase）启动子[31]控制rAAV载体来转导，其结果更进一步证实了这一发现。
rAAV载体特异性进入神经细胞近来已在小鼠脑内得到证实[40]。在大鼠和灵长目动物恒沙猴的实验中，也证实了rAAV介导hTH在神经细胞中特异性表达[41,38,42]。

3．rAAV介导产生的左旋多巴及其效果
在三个用rAAV-hTH治疗6-OHDA损伤小鼠的实验中[19,21]，仅有一个体内实验报道注射载体后产生左旋多巴[28]。研究者采用两种rAAV载体共同转染（其中一种用于表达BH4的主要生物合成酶—GTPCHI），则在6—OHDA单侧损伤的小鼠纹状体内，均能获得可测量的左旋多巴水平[28]。早期的离体基因治疗研究即强烈暗示，增加BH4（外源的或经基因转移后产生的）可促进TH表达后的左旋多巴释放[43-46]。然而,虽已明确知道TH活性依赖于BH4，但对于是否需要添加BH4还有争议，且确实有一用单纯疱疹病毒（HSV）载体转移hTH的研究无需外源BH4，即可测得左旋多巴水平[47]。
rAAV基因治疗的疗效和很多因素有关。首先是动物模型，不同的研究所用的动物模型不同[48]。常用的有单侧6-OHDA损伤模型，部分6-OHDA损伤模型，DA-/-模型[49]等。其次是动物种类，多用小鼠和大鼠，但也有用灵长目动物和啮齿类动物的。与这些有关的很多问题都会影响效果，所以难以确切地进行评价。Kaplitt等人[19]和Fan等人[21]的研究显示，纹状体rAAV-TH转导后，大大减少阿扑吗啡诱导的小鼠旋转行为[19,21]。Mandel等[28]在rAAV-TH和rAAV-hGTPCHI两种载体混合注射转导的研究中，测得很高的纹状体左旋多巴水平，对阿扑吗啡诱导的旋转行为却未见影响[28]。采用离体和体内两种方法进行基因转入的实验证实，仅转入THcDNA，而没有GTPTHI cDNA 或其他途径给予BH4，也减少单侧6-OHDA损伤小鼠PD模型中阿扑吗啡诱导的旋转行为[19,47,50-53]。其中只有采用HSV-TH转导的实验证实纹状体产生了可测量的左旋多巴，而这一实验用的是部分6-OHDA损伤模型。因此，左旋多巴的来源是不确定的[47]。此外，一个离体基因治疗实验揭示，只有增加外源的BH4，才可观察到TH基因转移可减少阿扑吗啡诱导的旋转行为[46]。相反，另两个离体基因治疗实验结果显示，TH和GTPCHI基因共同表达虽然成功地释放了左旋多巴，却没有减少阿扑吗啡诱导的旋转行为[43,44]。所以，rAAV-hTH基因治疗PD进入临床试验前，还有很多相关问题有待解决。

4．rAAV介导基因表达的长期性
Kaplitt等人报道，rAAV介导的LacZ和hTH基因表达可维持至少3-4个月[19]。其他一些研究也分别证明了在大脑不同部位注射rAAV后，转基因表达能持续3-6个月[31,37,54]。Mandel等人的研究显示，无论是CMV启动子还是MFG启动子控制的rAAV-hTH，其表达在六个月后均急剧地下降[28]，而CMV启动子控制的rAAV-hAADC和NES控制的绿色荧光蛋白（green fluorescence protein, GFP）表达均维持在六个月以上[55,31]。据此不难推测，TH转基因表达的减少可能是源于其本身的某些特性而不是源于所用载体和启动子。有研究者认为，TH在非多巴神经细胞中表达产生的是一种不稳定的蛋白[43,44]。
随后相继有实验证实AADC和GTPCH1蛋白可稳定TH，促进左旋多巴的分泌[56,44]。比如以逆转录病毒转导TH至9L-胶质肉瘤细胞，所得细胞为100%TH阳性。将其分为两等份，对其中一份细胞接着以逆转录病毒转入GTPCH1，培养后，取等量的两种细胞均质，用Western印迹法和免疫印迹法测TH含量。结果显示，转导有GTPCH1的培养细胞产生的TH更多[44]。体内实验也显示同样结果。比如用rAAV-hTH和rAAV-hTH与rAVV-hGTPCH1的1:1混合制剂注射单侧6-OHDA损伤小鼠后，免疫细胞化学染色法测定结果显示，同等的hTH表达水平所需两种制剂之比为2:1[28]。最近一组研究表明，rAAV-TH和rAAV-AADC的双重转导比单独转导rAAV-TH，更能促进多巴胺的分泌，对6-OHDA损伤的PD小鼠行为的恢复更有效[56]。而rAAV-TH，rAAV-AADC和rAAV-GTPCH1的三重转导比rAAV-TH和rAAV-AADC的双重转导导致更多的多巴胺产生，更有效地改善小鼠的旋转行为，且行为恢复可持续12个月[56]。这些结果说明了GTPCH1和AADC对TH的稳定及长期表达均有重要影响。 Mandel等人的实验说明rAAV-hTH在大脑表达能持续1年之久[28]。他们用CMV启动子和MFG启动子控制rAAV-hTH，其表达能持续1年[28]。他们还观察到rAAV介导的纹状体内AADC表达可长达1年[55]。虽然hTH这种长达1年的持续表达是不定量的，不能和6个月时的量相比，但是hTH这种持续表达说明了rAAV介导的转基因在大脑内表达是可以持久的。进一步支持此种说法的是一个DA-/-大鼠实验[41]。经rAAV-hTH和rAAV-hGTPCH1共同转染的DA-/-大鼠，无需给予额外的左旋多巴制剂，至少可存活14个月[41]。

5． 转基因表达的调控
虽然在动物模型实验中目前还未发现因纹状体内L—多巴过量产生的副作用，但是基因表达的可调控性是安全的基本要求。至今已经建立了几种通过小分子调控转基因转录的体系[57-60]。其中研究最多的是一种嵌合蛋白体系，这种嵌合体系由大肠杆菌来源的四环素抑制子和HSV VP16的活化域（tTA）构成，tTA可刺激与四环素操纵子序列（tetO）结合的最小启动子转录[57]。四环素与tTA蛋白的结合能抑制或诱导tTA的活化作用，其中所需的四环素浓度要低于抗生物活性浓度[57,61]。
最近，一研究小组构建了一种rAAV-tetO7-CMV-hTH载体，并观察其转导后是否有调节左旋多巴水平的能力。实验中把这种载体和rAAV-tTH载体共同转染Hela细胞，48小时后加入四环素，结果发现细胞中的hTH水平显著降低[62]。因此，构建能产生可控性左旋多巴水平的rAAV载体系统是可行的。由于rAAV系统的装载容量小，且有的实验为了能产生有效的左旋多巴水平，常常需要同时增加BH4（比如增加AADC或/和GTPCHI的转导），所以，一个有调控作用的rAAV转导系统至少需要有两种载体，一种用于表达tTA和其中一个转基因（如TH），另一种表达另一转基因（如GTPCHI）。

6． rAAV基因治疗的安全性
与病毒载体系统介导基因转入安全性相关的两个重要问题是野生型病毒污染载体制剂的可能性和重组载体发生同源重组而活化的可能性。由于野生型AAV是非致病病毒（80%以上的人可检测到AAV抗体），至今未见与其相关的疾病[17]。因此rAAV载体制剂含有少量野生型AAV污染是可以接受的。rAAV载体如发生同源重组而活化必须满足两个条件[63]：首先，必须有WtAAV提供的完整Rep和Cap基因[17]，其次需要有辅助病毒共同感染 [17]。然而，一个细胞同时被三种病毒（rAAV，WtAAV及辅助病毒）感染的机率是很小的，且大脑内WtAAV自发感染未能曾有过报道，所以rAAV同源重组活化的可能性非常小。另一个安全问题是载体注入大脑后的分布范围。临床要求转导只发生在纹状体部位，如向其它部位扩展可能造成无法预测的危害。实验显示,rAAV的纹状体内转导只定位于注射部位及其附近。比如注射1μlrAAV后，大约局限在一个中侧部为0．7mm、嘴尾部为1．5mm的范围[62]，而其他病毒载体转导后扩展范围更大或易于逆向输送[64-66]。
至于rAAV转导是否产生中枢神经系统毒性及其他免疫反应，至今还没有定论。
7． 结语
本文主要介绍用rAAV载体转基因直接分泌左旋多巴治疗PD的实验进展情况。当然，其他载体系统如腺病毒[51]，单纯疱疹病毒[47]或慢病毒[65,67,68]均可考虑用于PD的治疗试验[69]。各种载体各有其优缺点，rAAV载体系统的一大优点就是安全系数高。一些相关问题，如基因表达的调控，毒性检测，更贴近自然的PD模型构造等日后若能得到解决，那么在不久的将来，rAAV介导的这种直接分泌多巴的基因治疗即可应用于PD临床试验。

[第2楼 PID1092] 2012-08-20 19:27 Robot :

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